METODICHE

Lo studio molecolare delle malattie genetiche prevede l’estrazione del DNA dal campione biologico e nella maggior parte dei casi una reazione di amplificazione del DNA estratto con tecnica di Polymerase Chain Reaction (PCR). La fase analitica successiva e’ rappresentata generalmente dal sequenziamento automatico del frammento amplificato in PCR. La ricerca di mutazioni viene quindi eseguita confrontando la sequenza ottenuta per il campione in esame con la sequenza di riferimento (sequenza detta “wild-type”, cioè normale). Nel caso in cui le mutazioni che determinano una precisa patologia siano note ed in numero limitato, si può procedere alla sola ricerca di tali mutazioni invece di analizzare l’intero gene.

 

La citogenetica è quella branca della genetica umana  si occupa dello studio dei cromosomi (cariotipo), in particolare della loro struttura , dei meccanismi e delle modalità con cui vengono ereditati. Lo scopo è quello di identificare  e studiare le anomalie sia nella struttura dei cromosomi (anomalie cromosomiche) sia nel loro numero (anomalie genomiche), la cui presenza è alla base di condizioni patologiche specifiche o di riduzione della fertilità.  Inoltre, tale metodica consente la della determinazione cromosomica del sesso.

L’analisi del cariotipo può essere eseguita sia in epoca prenatale sia in epoca postnatale:

-in epoca prenatale viene eseguita sulle cellule del liquido amniotico o su quelle dei villi coriali e permette di conoscere in modo certo se il feto è affetto da alterazioni del patrimonio cromosomico, come anomalie cromosomiche sia numeriche (trisomie e monosomie), sia strutturali, come traslocazioni, delezioni, duplicazioni ed inversioni.

-In epoca postnatale permette di riconoscere anomalie cromosomiche che si associano ad una condizione patologica, ad una riduzione della fertilità o ad una maggiore probabilità di generare figli affetti da patologia causata da anomalie cromosomiche.

 

L’analisi mediante sequenziatore automatico è anche utilizzato per l’analisi di frammenti. Una delle applicazioni di questo tipo di analisi realizzata nel Laboratorio di Genetica del Centro AMES è la Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) in diagnosi prenatale impiegata per individuare alterazioni numeriche relative ai soli cromosomi 13, 18, 21 e ai cromosomi sessuali X e Y.

 

La tecnica MLPA (Multiple Ligation dependent Probe Amplification) è utilizzata per la ricerca di riarrangiamenti, delezioni o duplicazioni, per l’analisi delle regioni introniche o regolatorie per i difetti di splicing di un gene. La tipologia di analisi molecolare eseguita può essere diversa rispetto a quelle sopraindicate a seconda dei dati emersi dalla consulenza genetica. In alcuni casi per il completamento dell’analisi può essere necessario eseguire l’esame anche sui genitori o su altri familiari della persona che ha richiesto un’analisi molecolare.

 

Il cariotipo molecolare o ibridazione genomica comparativa su microarray (Array - Comparative Genomic Hybridization o Array-CGH) è una tecnica di citogenetica molecolare, dotata di ampio potere risolutivo, che consente di identificare anomalie cromosomiche di tipo numerico (aneuploidie) a carico dei 22 autosomi e dei cromosomi sessuali (X e Y), e anche variazioni del numero di copie (CNV) di sequenze del DNA umano, come duplicazioni/amplificazioni (presenza in eccesso di materiale genetico) o delezioni (perdita di materiale genetico), rispetto al livello di ploidia del DNA di un campione rispetto ad un controllo di riferimento.

Il CGH array ha aumentato la capacità di rilevare varianti genomiche (CNV) patologiche presenti in pazienti con ritardo globale dello sviluppo, ritardo mentale, autismo, anomalie congenite multiple e dismorfismi.

 

La NGS è una nuova tecnologia che consente grazie alla produzione di miliardi di sequenze di DNA in forma di corti frammenti, di costruire una mappa dei geni coinvolti in numerose patologie.

Con tale analisi è possibile identificare mutazioni,  in singoli geni (gene SHOX, gene RET) o in un pannello di oltre 4800 geni, http://www.illumina.com/products/trusight-one-sequencing-panel.html ,correlate alle patologie genetiche più diffuse ed ad oggi conosciute. E’ possibile inoltre verificare la predisposizione a diversi tumori (BRCA1- BRCA2 per la predisposizione al carcinoma mammario e ovarico).

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