Soggetti diversi rispondono in modo diverso allo stesso farmaco; tali differenze sono legate al grande numero di proteine che intervengono nella risposta alla terapia farmacologica. Ogni proteina e’ prodotta da una specifica sequenza di DNA, il gene; la maggior parte dei geni presenta caratteristiche diverse in individui diversi. Una nuova disciplina, la FARMACOGENETICA, si propone di studiare le variazioni nella sequenza dei geni (“varianti polimorfiche”) responsabili dell’efficacia della terapia farmacologica in un determinato individuo. Test del DNA, che identificano queste varianti polimorfiche, sono in grado di predire, almeno in parte, come un paziente risponderà ad un determinato farmaco. I risultati del test genetico saranno utilizzati dal medico per scegliere quale farmaco impiegare per il trattamento del paziente e per ottimizzare il dosaggio da somministrare:"il farmaco giusto al paziente giusto". Le varianti polimorfiche in farmacogenetica vengono ricercate nei geni responsabili del metabolismo, del trasporto, dell’assorbimento,della distribuzione e dell’escrezione del farmaco nonché in quei geni che producono le proteine dei recettori del farmaco stesso.

Gli isoenzimi appartenenti al sistema del CYP450 sono responsabili del metabolismo di molti farmaci comunemente prescritti in quanto catalizzano la maggior parte delle reazioni di ossidazione che avvengono a livello epatico (reazione di fase I). Tra le numerose isoforme del CYP450, il Citocromo P450 isoforma 2D6 (CYP2D6) è coinvolto nel metabolismo ossidativo del 25% circa dei farmaci correntemente prescritti.

I genotipi 2D6 risultano altamente variabili tra i diversi individui, non solo perché esistono numerosi

polimorfismi a carico di questo gene ma anche perché un evento di duplicazione determina in alcuni di essi l’esistenza di più copie attive del gene. In base al genotipo sono state individuate quattro categorie fenotipiche: UM “ultra rapid metabolizers”, EM “extensive metabolizers”, IM “intermediate metabolizers” e PM “poor metabolizer”. I soggetti con fenotipo “extensive” o “intermediate” hanno un’attività enzimatica rispettivamente normale o inferiore ai limiti della norma, mentre i metabolizzatori “poveri” i PM e gli “ultra-rapidi” UM, presentano una capacità metabolica rispettivamente molto inferiore o molto superiore ai livelli

normali. Gli individui appartenenti a queste due ultime categorie possono essere soggetti a reazioni avverse oppure a ridotti effetti terapeutici se il farmaco somministrato è substrato del prodotto del gene CYP2D6.

 

Il test genetico:

consiste nell’identificazione delle varianti polimorfiche dell’intero gene del citocromo CYP2D6 mediante NGS (Next Generation Sequencing) e conferma delle varianti geniche rilevate con NGS mediante sequenziamento diretto Sanger.

 

Il test si esegue:

su DNA estratto da linfociti di sangue periferico (2 provette da 3mL di sangue intero in provetta Vacutainer con EDTA).

 

Indicazione all’analisi:

l’analisi viene eseguita in soggetti in cui si verifica l’ assenza di effetti terapeutici o l’ insorgenza di effetti collaterali in seguito a somministrazione di terapie a base di farmaci substrato del CYP2D6.

 

DIAGNOSI MOLECOLARE IN ONCOLOGIA

 

La diagnostica molecolare in oncologia ha avuto il suo maggiore impatto nella diagnosi e nel trattamento del cancro al seno, ma anche nella diagnosi di tumore del colon-retto, del cancro del polmone e della prostata al fine di ridurne la mortalità. Nella lotta contro il cancro, la diagnostica molecolare è uno strumento di rilevamento precoce e di gestione della malattia, la chiave per una gestione più efficace del cancro e il fondamento della medicina personalizzata.

 

Mediante l’impiego della tecnologia NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS). E’ possibile inoltre verificare la predisposizione a diversi tumori (BRCA1- BRCA2 per la predisposizione al carcinoma mammario e ovarico).

Il test genetico BRCA1 e BRCA2 (Breast Cancer 1 e 2) è un test di laboratorio in grado di identificare alterazioni ereditarie nei geni BRCA1 e BRCA2 con un semplice prelievo ematico.

Questi geni regolano, attraverso un meccanismo non ancora del tutto noto, la corretta crescita e proliferazione delle cellule della mammella e dell’ovaio.

A seguito di approfonditi studi effettuati su famiglie a rischio, è stato accertato che le donne che possiedono mutazioni ereditarie a livello dei geni BRCA1 e BRCA2 rischiano di sviluppare un tumore alla mammella nell’87% dei casi, contro una probabilità del 10% dei non portatori di mutazioni.

Recenti studi hanno inoltre dimostrato che più della metà delle donne portatrici di mutazioni a livello dei geni BRCA sviluppa un tumore al seno prima dei 50 anni.

Il rischio di sviluppare un tumore ovarico in caso di ricorrenza di mutazioni in uno dei due geni in questione è compreso tra il 44-60%, rispetto all’1% di probabilità dei non portatori.

 

Inoltre, il Centro Ames effettua un ricco portafoglio di test che puntano alla rilevazione di mutazioni genetiche e di misurare l'espressione genica di tessuti tumorali fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE).

I saggi, con una sensibilità eccezionale (1%) e l'accuratezza (99%), si basano su una PCR real time denominata "ADx-ARMS" per rilevare le mutazioni somatiche più comuni di diversi geni come EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA, EML4-ALK, ROS1.

In particolar modo il kit per:

 

EGFR

l'individuazione delle mutazioni somatiche più informative del gene del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR). La presenza di mutazioni di EGFR sono ricercate in pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule metastatico per predire la sensibilità a Iressa. Infatti, in Cina queste mutazioni sono selezionati in pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), che hanno più probabilità di rispondere a Iressa (Gefitinib) o Tarceva (Erlotinib).

 

KRAS

La presenza di mutazioni del gene KRAS in pazienti con carcinoma colorettale è rilevante per la resistenza a farmaci mirati come gli inibitori della tirosin-chinasi. I pazienti affetti senza mutazioni del gene KRAS sono molto più propensi a beneficiare del Erbitux (Cetuximab) o Vectibix (Panitumumab), rispetto ai pazienti con un gene KRAS mutato. L’ Organizzazione europea “Drug Administration “e US FDA ha raccomandato l'impiego del test KRAS per rilevare eventuali mutazioni genetiche prima l'utilizzo mirato del farmaco Cetuximab e Vectibix nel trattamento del cancro colorettale.

 

NRAS

NRAS è un membro della famiglia RAS di piccole GTPasi e svolge un ruolo centrale nella vie di segnalazione MAPK.

NRAS è stato implicato nella patogenesi di diversi tumori.

Mutazioni ANR sono particolarmente comuni nel melanoma, nel carcinoma epatocellulare, nella leucemia mieloide e nel carcinoma della tiroide. In totale, si verificano mutazioni attivanti nei geni ANR nel 13 ~ 25% dei melanomi cutanei, nel 1 ~ 6% di cancro del colon-retto e nel 1% di cancro al polmone,principalmente negli esoni 2, 3 o 4.

La presenza di mutazioni del gene NRAS è rilevante per la resistenza ai farmaci nel carcinoma non a piccole cellule del polmone trattati con inibitori della tirosin-chinasi.

 

BRAF

BRAF è una serin/ treonin chinasi che svolge un ruolo all'interno del pathway di Ras-Raf-MEK-MAPK. Questo percorso, sotto il controllo dei fattori di crescita e ormoni, normalmente regola la proliferazione e sopravvivenza cellulare. Le mutazioni nel gene BRAF sono state associate con lo sviluppo del cancro. Mutazioni di BRAF si verificano in circa il 50% dei melanomi, in ~ 40% dei tumori tiroidei papillari,in  ~ 30% dei tumori ovarici, in ~ 10% dei tumori del colon-retto e in ~ 10% dei tumori della prostata. I farmaci che bloccano la attivazione oncogenica di BRAF hanno avuto risultati impressionanti negli studi clinici e la ricerca di nuovi farmaci mirati a BRAF è un'area attiva di ricerca e sviluppo.

 

EML4-ALK

L'oncogene di fusione EML4-ALK rappresenta uno dei più nuovi bersagli molecolari nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Questa fusione comportai una piccola inversione all'interno cromosoma 2p. Questa inversione è responsabile dell'espressione di una tirosina chinasi chimerica avente la metà N-terminale della proteina 4 (EML4) del microtubulo di echinodermi fusa al dominio chinasico intracellulare del linfoma anaplastico (ALK). La proteina EML4-ALK possiede una potente attività oncogenica sia in vitro che in vivo. Questa attività può essere bloccata da piccole molecole inibitorie, sostenendo il ruolo di EML4-ALK come un fattore chiave di tumorigenesi polmone.

 

PIK3CA

Esistono mutazioni del gene Phosphoinositide-3-chinasi subunità alfa catalitica (PIK3CA) in diversi tipi di tumori, tra cui il cancro al seno ed il cancro del polmone non a piccole cellule. La mutazione di PIK3CA può portare all'attivazione persistente del pathway a valle associate con lo sviluppo e la diffusione del cancro.

 

ROS1

ROS1 è un tirosin-chinasi recettoriale della famiglia dei recettore dell'insulina. Riarrangiamenti cromosomici che coinvolgono il gene del recettore tirosina chinasi ROS1 si verificano in un sottogruppo di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). I partner di fusione di ROS1 includono SLC34A2, CD74, SDC4, EZR ecc Queste fusioni portano all’attività chinasi costitutiva ed l'attivazione di percorsi a valle, come JAK / STAT, PI3K / AKT, RAS / MAPK, ecc, che porta alla carcinogenesi.

 

JAK2

La famiglia di JAK tirosin-chinasi non-recettore, comprende JAK1, JAK2, JAK3, e TYK2. I fattori di crescita e le citochine sono in grado di regolare la trascrizione genica attraverso l'attivazione JAK-dipendente del trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione (STAT). La trasduzione JAK-STAT del segnale regola la proliferazione cellulare, il differenziamento, l'apoptosi e la regolazione immunitaria. L’attivazione di JAK2 da mutazione del ammioacido in posizione 617 (V617F) è associata a disturbi mieloproliferativi, compresa la policitemia vera (mutazioni trovate nel 90% dei casi), la trombocitemia essenziale (50%) e l’mielofibrosi idiopatica (50%). Mutazione JAK2 è il principale indicatore in diagnostica di MPD. La mutazione JAK2 V617F è stata trovata in tre dei 24 campioni di cancro del polmone mediante sequenziamento dell’esoma. Se questa scoperta viene convalidata rappresenterà una nuova mutazione importante causativa del cancro del polmone, con l'ulteriore vantaggio che la chinasi mutante è inibita da farmaci ben studiati, come gefitinib.

 

BCR-ABL

Il AmoyDx BCR-ABL Mutation Detection Kit è un test sensibile e selettivo per la rilevazione della mutazione T315I nel gene BCR-ABL. La maggior parte (95%) dei pazienti con leucemia mieloide cronica (CML) ha un riarrangiamento cromosomico che produce l'oncogene di fusione BCR-ABL1. I pazienti con LMC in genere rispondono molto bene al trattamento con l'inibitore della tirosin-chinasi imatinib mesilato, conosciuta come Gleevec negli Stati Uniti e Glivec in Europa. Tuttavia, le cellule LMC in pazienti trattati con TKI possono sviluppare resistenza al farmaco a causa della comparsa della mutazione puntiforme T315I nel dominio della chinasi BCR-ABL. Nuovi inibitori come dasatinib e nilotinib sono significativamente più potenti di imatinib e possono superare la resistenza.

 

TYMS

Timidilato sintetasi (TYMS) catalizza la metilazione di deoxyuridylate a deossitimidilato, che è un metabolita chiave per la replicazione e riparazione del DNA. I malati di cancro con un basso livello di espressione genica TYMS possono essere più sensibili al trattamento con la chemioterapia con fluorurati. Questo kit permette la valutazione quantitativa dell'espressione genica TYMS nel tessuto del cancro.

 

ERCC1

Il test ERCC1 fornisce informazioni sulla potenziale sensibilità del cancro di un paziente alle terapie a base di platino.

La combinazione di carboplatino e paclitaxel è il regime più comunemente usato per il trattamento del tumore non a piccole cellule del polmone (NSCLC). Questi farmaci inibiscono la crescita del cancro danneggiando il DNA. L'espressione del gene di riparazione del DNA di escissione riparazione cross-complementazione gruppo 1 (ERCC1) è segnalata per essere correlata con resistenza ai farmaci a base di platino. Le cellule tumorali con bassa livello di enzima ERCC1 possono essere più sensibili ai farmaci a base di platino dal momento che sono meno in grado di riparare il DNA danneggiato.

 

C-KIT

KIT è un recettore tirosina chinasi (RTK) che svolge normalmente un ruolo critico nella emopoiesi. La mutazione del gene KIT conduce alla crescita aberrante della cellula ospitante la proteina mutante. Mutazioni di KIT sono state associate a diverse neoplasie, tra cui la leucemia mieloide acuta (AML), tumori stromali gastrointestinali (GIST) e carcinomi testicolari.

 

RRM1

Gene RRM1 è l'abbreviazione di ribonucleotide reduttasi M1. La gemcitabina è l'analogo DCTP ed è l'inibitore della ribonucleotide reduttasi. RRM1 è uno degli obiettivi della gemcitabina. È stato dimostrato che. un alto livello di espressione di RRM1 è collegato con la resistenza alla gemcitabina. Inoltre, i pazienti oncologici in uno stadio avanzato con un alto livello di espressione di RRM1 hanno prognosi infausta. Pertanto, la valutazione quantitativa dell'espressione genica RRM1 potrebbe determinare l'idoneità di gemcitabina a pazienti affetti da cancro NSCL e stimarne la prognosi.

 

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